草酸盐

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草酸钛钾紫外分光光度法快速测定葡萄糖
2015-11-5    :www.caosuanyan.com    0

    高 娜,何保山*,魏 芳,陆启玉
    (河南工业大学粮油食品学院,郑州450001)
    摘要:应用紫外分光光度法分析技术建立了快速测定葡萄糖的检测方法。利用样品中葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下生成的过氧化氢具有强氧化性,可以将还原性的草酸钛钾氧化生成稳定的黄色络合物。络合物在最大吸收波长382 nm处的吸光值与样品中葡萄糖的质量浓度成比例。结果显示葡萄糖质量浓度在0.05~0.75 mg/mL的范围内具有良好的线性关系,相关系数为0.996,相对标准偏差为1.67%,加标回收率为99.87%~100.39%。方法操作简便、可靠,可以用于样品中葡萄糖的快速测定。
    关键词:紫外分光光度法;葡萄糖;快速测定;草酸钛钾
    中图分类号:TS 207 文献标志码:B 文章编号:1005-9989(2012)11-0282-04

    葡萄糖的定量测定在食品分析、生物化学和临床医学中都占有很重要的地位。目前,用于淀粉发酵液中葡萄糖含量的快速检测较少,主要应用方法有:滴定法、气相色谱法、高效液相色谱法和电化学分析法等。其中滴定法原理简单,但操作不便误差较大[1-2];气相色谱法具有良好的线性关系,但是葡萄糖需经过硅醚化处理,操作比较复杂[3-5];高效液相色谱法反应灵敏度高,结果较准确,但是进样分析时间长,不适于快速测定,而且仪器设备价格高昂,推广和普及有一定的困难[6-8]。电化学分析法仪器结构简单、操作方便、便于携带且准确度高,但检测易受其他物质干扰,选择性较差,实用性有待进一步完善[9-10]。因此,开发快速、准确、可应用于淀粉发酵液中葡萄糖含量的快速检测方法在食品加工行业具有重要的现实意义。本工作即利用葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下首先生成过氧化氢,草酸钛钾在过氧化氢的氧化作用下产生特异性显色反应,基于紫外分光光度装置建立了一种快速测定葡萄糖的分析方法,并对反应条件、反应时间进行了优化,取得了满意的结果。
    1 材料与方法
    1.1 材料与试剂
    葡萄糖、糊精;葡萄糖氧化酶;草酸钛钾;麦芽糖;可溶性淀粉;生理盐水(0.9%氯化钠注射液);所用试剂均为分析纯;试验所用水为二次蒸馏水。试验在室温下进行。
    1.2 仪器与设备
    TU-1900双光束紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;AY120型电子分析天平:感量0.0001 g,日本岛津仪器公司。
    1.3 试验方法
    1.3.1 草酸钛钾(PTO)溶液(0.0354 g/mL)的配制 准确称取0.0354 g草酸钛钾分析纯置于1000 μL的生理盐水中,充分溶解,备用。
    1.3.2 葡萄糖标准溶液(0.1 g/mL)的配制 准确称取0.1 g葡萄糖样品置于1000 μL的生理盐水中,充分溶解,备用。
    1.3.3 葡萄糖氧化酶(GOD)标准溶液(100 U/250μL)的配制 在装有100 U/10 μL葡萄糖氧化酶的离心管中,加入240 μL的生理盐水,混合均匀,备用。
    1.3.4 样品中葡萄糖的测定 测试时,首先分别移取150 μL葡萄糖氧化酶、75 μL草酸钛钾、175μL缓冲溶液至2.5 mL的石英比色皿中,再移取100 μL检测试样至比色皿中,立即置于TU-1901双光束紫外分光光度计中,测量其在波长382 nm的吸光值,通过吸光值与葡萄糖质量浓度间的响应关系得知样品中葡萄糖的含量。
    2 结果与分析
    2.1 显色反应生成物最大吸收波长的确定试验中首先对葡萄糖与显色剂间结合反应的光谱特点进行考察。试验分别对游离的草酸钛钾溶液以及葡萄糖-草酸钛钾的反应溶液进行了光谱扫描,结果如图1所示。
    图1 游离PTO溶液和葡萄糖-PTO反应光谱图

    由图1可以看出,在200~900 nm之间的整个扫描区间内,游离的草酸钛钾溶液并没有明显的吸收峰(图1曲线1)。当溶液中引入葡萄糖后,葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下生成过氧化氢,游离的草酸钛钾与过氧化氢发生快速显色反应,光谱曲线在波长382 nm处出现了明显的吸收峰(图1曲线2),此应为游离的草酸钛钾与过氧化氢反应后生成物的特征吸收峰。因此,试验中将显色反应的最大吸收波长定为382 nm。
    2.2 草酸钛钾用量的优化试验固定比色皿中葡萄糖溶液的浓度为0.1 g/mL,改变PTO用量,分别移取10、25、50、75、100 μL 0.0354 g/mL PTO置于比色皿中,立即置于紫外分光光度计中,在波长382 nm处进行时间扫描,结果如图2所示。
    由图2可以看出,反应体系中PTO引入量从10 μL增加50 μL时,反应时间逐渐缩短,生成物的吸光值也逐渐增大;当PTO的引入量从50 μL增加到100 μL时,反应时间和吸光值的变化都不明显。在显色反应中,为了避免操作误差对实验结果造成影响,应选择趋于稳定后的中间值。因此,将PTO的引入量定为75 μL。
    2.3 葡萄糖氧化酶用量的优化试验固定比色皿中葡萄糖溶液的浓度为0.1 g/mL,浓度为0.0354 g/mL的PTO引入量为75 μL,改变GOD用量,分别移取10、25、50、75、100、125、125、150、175 μL 100 U/250 μL GOD置于比色皿中,立即置于紫外分光光度计中,在波长382 nm处进行时间扫描,结果如图3所示。
    充液和100 μL的葡萄糖标准溶液置于比色皿中充分混合,在紫外可见光分光光度计上进行时间扫描,结果如图4所示。
    由图4可以看出,葡萄糖在GOD催化作用下生成的过氧化氢与PTO的结合反应非常迅速,1 min后生成物吸光值即可达到稳定。因此,选择反应时间为1 min。
    2.5 标准曲线的制作
    在最优化的检测条件下,应用上述建立的紫外分光光度法对浓度为0.01~10 mg/mL的葡萄糖样品进行检测,结果如图5所示。经试验,葡萄糖浓度在0.05~0.75 mg/mL范围内吸光值与葡萄糖浓度呈现良好的线性关系,线性回归方程为
    y=0.2059x-0.0087,相关系数R=0.996。
    图3 不同GOD用量下的反应时间扫描曲线
    图4 PTO测定葡萄糖反应的时间扫描曲线
    图5 葡萄糖浓度与吸光值(Abs)的拟合直线图
    图6 麦芽糖、糊精、可溶性淀粉对反应的影响

    注:1.10 μL;2.25 μL;3.50 μL;4.75 μL;5.100 μL;6.125
    μL;7.150 μL;8.175 μL。
    由图3可以看出,随着GOD引入量的增加,反应时间逐渐缩短,生成物的吸光值也逐渐增大;当PTO的引入量大于125 μL时,反应时间和吸光值的变化都不明显。在显色反应中,为了避免操作误差对试验结果造成影响,应选择趋于稳定后的中间值。因此,在节约时间和试剂,并保证试验可靠性的前提下,将GOD的引入量定为150μL。
    2.4 反应时间的确定
    试验中将测量波长点定为382 nm,依次移取150 μL GOD、75 μL PTO、2175 μL生理盐水补
    2.6 干扰物试验
    试验中将麦芽糖、糊精、可溶性淀粉作为干扰物质引入草酸钛钾和葡萄糖、葡萄糖氧化酶的反应体系中,在紫外分光光度计上进行光谱扫描。结果显示,在反应体系中分别加入麦芽糖、糊精、可溶性淀粉后的光谱扫描曲线和只添加葡萄糖的光谱扫描曲线几乎重合,说明上述3种物质不与草酸钛钾发生反应,在最大吸收波长382 nm处不产生吸收(图6),对显色反应不产生影响。这说明本方法抗干扰能力强,对样品中葡萄糖的选择性高。
    注:1.葡萄糖;2.麦芽糖+葡萄糖;3.可溶性淀粉+葡萄糖;4.糊精+葡萄糖。
    2.7 精密度试验
    在最优化的检测条件下,对同一浓度的葡萄糖溶液作12次平行检测,结果表明。该方法测定稳定,相对标准偏差小于2%,重现性符合测定要求。
    2.8 加标回收率试验
    分别取葡萄糖样品溶液和葡萄糖对照品溶液,应用上述建立的紫外分光光度法进行检测,得出吸光值之后,根据标准曲线得出溶液浓度。根据下列公式计算回收率,如表1所示。结果表明,回收率为99.87%~100.39%,说明该方法准确度高。
    加标回收率(%)=(加标试样测定值-试样测定值)÷加标量×100
    表1 回收率试验结果 mg/mL
    序号本底值加入量测得量回收率/%
    1 0.50 0.35 0.42 99.87
    2 0.50 0.40 0.45 100.39
    3 0.50 0.45 0.47 99.32
    3 结论
    本研究建立的葡萄糖紫外分光光度法分析技术,葡萄糖质量浓度在0.05~0.75 mg/mL具有良好的线性关系,精密度与准确度均良好,检测时间为1 min,实现了样品中葡萄糖含量的快速定量检测,对食品发酵行业、饮食健康和医疗保健方面都具有十分重要的意义。
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